ІНСТРУКЦІЯ
з дослідження сироватки на наявність резус-антитіл
Резус-антитіла належать до ізоімунних антитіл, яких в нормі немає в сироватці людини, а з'являються в крові резус-негативних людей тільки внаслідок імунізації.
Умовами, що сприяють утворенню антитіл, є введення резус-негативній людині резус-позитивної крові або вагітність резус-негативної жінки резус-позитивним плодом.
Визначення резус-антитіл разом з визначенням резус-належності хворого і донора необхідне для запобігання імунному конфлікту внаслідок переливання резус-несумісної крові, а також для діагностики резус-конфлікту вагітних і можливого захворювання плода або новонародженого на гемолітичну хворобу.
Визначення резус-антитіл важливе також при відборі матеріалу для приготування сироватки анти-резус.
Резус-антитіла бувають різні за специфічністю: анти-D(Rh0), антиC(rh'), анти-E(rh''), анти-c(hr'), анти-e(hr'') і за формою: повні і неповні.
Специфічність антитіл визначається тим, з якими із резус-антигенів вони реагують. Форма антитіл визначається тим, яким чином вони реагують з еритроцитами, що несуть на собі специфічні для них резус-антигени.
Повні антитіла, що з'єднуються з резус-антигенами еритроцитів, викликають аглютинацію (склеювання) цих еритроцитів під час реакції в сольовому середовищі. Неповні антитіла в цих умовах тільки з'єднуються з еритроцитами, але не викликають аглютинації, так що зовні ця реакція нічим не проявляється.
Для того, щоб встановити, чи пройшла реакція між неповними резус-антитілами і еритроцитами, необхідні спеціальні умови, зокрема, додавання колоїдних розчинів (желатину, поліглюкіну) або використання сироватки для проби Кумбса, яка реагує з імуноглобулінами людини (непряма проба Кумбса). За всіх зазначених умов реакція між резус-антитілами і еритроцитами, що мають резус-антиген, у кінцевому результаті також проявляється у вигляді аглютинації еритроцитів.
Різні методи визначення резус-антитіл вимагають різних оптимальних для них температурних умов.
З метою забезпечення трансфузійної терапії, профілактики посттрансфузійних ускладнень гемолітичного типу необхідно проводити переливання крові, беручи до уваги алосенсибілізацію донорів і реципієнтів антигенами еритроцитів.
Кров донорів, вагітних жінок і хворих рекомендовано досліджувати на наявність антитіл до антигенів еритроцитів незалежно від їх резус-належності. Якщо виявлено антитіла, цільну кров або плазму донора не можна використовувати для переливання.
Титр і специфічність виявлених антитіл досліджують під час кожної кроводачі. Донори, які не мають в сироватці антитіл до антигенів еритроцитів, проходять кожен рік повторне дослідження.
Первинне дослідження антитіл у крові донорів здійснюють лабораторії закладів служби крові з допомогою реакції конглютинації з 10% розчином желатину та сумішшю еритроцитів
3 – 5 донорів групи 0(I) Rh+ і 3 - 5 донорів 0(I) Rh- з оцінкою результату під мікроскопом.
У тому випадку, коли антитіла до антигенів еритроцитів виявляли (або не виявляли, але в анамнезі були множинні гемотрансфузії або ускладнення вагітності), дослідження антитіл повторювали в антиглобуліновому тесті в лабораторії, яка має панель типованих еритроцитів.
1. Загальні зауваження про методи визначення анти-резус-антитіл
1.1. Облік специфічності антитіл та стандартних еритроцитів У разі імунізації резус-негативних людей повторними трансфузіями крові або під час вагітності утворюються антитіла анти-D(Rh0), але за цих умов можуть утворюватись і інші резус-антитіла.
Тому під час визначення антитіл у сироватці крові людини цю сироватку досліджують зі стандартними резус-позитивними еритроцитами, що обов'язково мають три резус-антигени: D(Rh0), C(rh'), E(rh'').
Якщо антигени C(rh') і E(rh'') в еритроцитах спеціально не визначали, то число резус-позитивних зразків повинно бути не менше 20 для того, щоб серед них обов'язково зустрілись ці три резус-антигенти.
Як контроль на специфічність реакції, а також для виявлення антитіл анти-c(hr') і e(hr'') в дослідження включають стандартні резус-негативні cde(rh0) еритроцити і, якщо можливо, власні еритроцити особи, сироватку якої досліджують.
Таке дослідження є попереднім. Для уточнення специфічності потрібні додаткові специфічні дослідження.
1.2. Облік форми антитіл
Найчастіше у разі імунізації факторами групи Rh утворюються неповні антитіла; інколи одночасно з ними утворюються і повні.
Крім того, зустрічаються випадки, коли у людини утворюються тільки повні резус-антитіла.
Тому визначення резус-антитіл слід проводити не менш як двома методами, одним з яких обов'язково повинен бути метод сольової аглютинації, що виявляє повні антитіла, а другий - будь-який метод, що виявляє неповні антитіла.
1.3. Вибір методу виявлення резус-антитіл
Існують різні методи дослідження сироваток. З них непряма проба Кумбса, реакція із застосуванням желатину і реакція із застосуванням поліглюкіну виявляють неповні резус-антитіла, і з цією метою може бути використаний будь-який з них.
Метод дослідження сироватки в сольовому середовищі виявляє повні резус-антитіла і обов'язково має використовуватись одночасно з будь-яким із згаданих вище.
2. Дослідження сироватки на наявність неповних резус-антитіл непрямою пробою Кумбса
2.1. Попередня обробка стандартних еритроцитів
Кров для приготування еритроцитів беруть у кількості 0,5 - 1,0 мл у звичайні пробірки місткістю не менше 10 мл, в які налито 0,25 мл 3,8 - 5,0% розчину натрію цитрату. Пробірки нумерують і пишуть на них прізвище, ініціали, групу крові і резус-належність особи, від якої взято кров. Пробірки доливають доверху 0,9% розчином натрію хлориду, потім вміст пробірок перемішують, центрифугують і відсмоктують відмивну рідину. Таке відмивання повторюють двічі.
Після відмивання на дні пробірки залишаються відмиті еритроцити, які і застосовують для дослідження сироватки.
2.2. Техніка обстеження
2.2.1. В штатив вставляють і нумерують пробірки за числом і нумерацією зразків еритроцитів, з якими досліджують сироватку.
2.2.2. У всі пробірки вводять по 3 краплі (0,15 мл) досліджуваної сироватки.
2.2.3. З дна кожної пробірки, що містить відмиті стандартні еритроцити, дуже тонкою пастерівською піпеткою набирають 1 маленьку краплю (0,01 мл) еритроцитів і переносять її в пробірку з досліджуваною сироваткою відповідно з нумерацією пробірок.
2.2.4. Вміст пробірок старанно перемішують шляхом струшування і ставлять для інкубації в термостат на 45 хв. при температурі 37 о C. За цей час резус-антитіла, якщо вони є в досліджуваній сироватці, фіксуються на еритроцитах.
2.2.5. Після інкубації в пробірки доливають доверху ізотонічний розчин натрію хлориду, вміст пробірок перемішують і центрифугують за швидкості ротора 1500 об./хв. протягом 5 хв. при кімнатній температурі, після чого надосадову рідину відсмоктують.
Таке відмивання еритроцитів повторюють 3 - 4 рази.
2.2.6. У кожну пробірку до відмитих таким чином еритроцитів додають 4 - 7 крапель ізотонічного розчину натрію хлориду для одержання 5% завису.
2.2.7. Одну краплю (0,05 мл) завису еритроцитів із кожної пробірки переносять на білу порцелянову або будь-яку іншу білу пластинку зі змочуваною поверхнею і до кожної краплі додають по одній краплі (0,05 мл) сироватки, заготовленої для проби Кумбса.
2.2.8. Сироватку старанно перемішують з еритроцитами (скляною паличкою або кутом предметного скла), після чого пластинку злегка похитують, спостерігаючи результат (наявність або відсутність аглютинації еритроцитів).
Аглютинація звичайно починається протягом 10 - 30 сек., Але при низькому титрі резус-антитіл може настати значно пізніше, тому спостереження слід продовжувати до 20 хв.
Аглютинація в цих випадках відбувається внаслідок того, що сироватка для проби Кумбса з'єднується з антитілами, а поскільки останні фіксовані на еритроцитах, то еритроцити також втягуються в реакцію, яка проявляється у вигляді аглютинації.
2.3. Оцінка результату реакції
Наявність аглютинації в краплях і зразками резус-позитивних еритроцитів і відсутність її з резус-негативними і власними еритроцитами вказує на присутність в сироватці неповних резус-антитіл.
Відсутність аглютинації з усіма зразками еритроцитів вказує на те, що неповні резус-антитіла - анти-D(Rh0), C(rh'), E(rh''), c(hr'), e(hr'') - не виявлено.
2.4. Титрування сироватки, що має неповні антитіла
2.4.1. В штатив встановлюють 10 пробірок з позначками: 1:2, 1:4, 1:8 і т. д. до 1:1024.
2.4.2. У всі пробірки вводять по 3 краплі (0,15 мл) 0,9% розчину натрію хлориду.
2.4.3. У першу пробірку (з позначкою 1:2) вводять 3 краплі (0,15 мл) досліджуваної сироватки. З першої пробірки після перемішування її вмісту переносять 3 краплі в наступну і т. д. до останньої пробірки, з якої 3 краплі виливають. У результаті в пробірках утворюється розведення досліджуваної сироватки від 1:2 до 1:1024.
2.4.4. У всі пробірки пастерівського піпеткою додають по одній маленькій краплі (0,01 мл) стандартних резус-позитивних еритроцитів або суміш еритроцитів, одержаних від 4 – 5 резус-позитивних осіб і приготовлених так само, як готують стандартні еритроцити.
2.4.5. Вміст пробірок перемішують і штатив ставлять на 45 хв. у термостат при температурі 37оC.
2.4.6. Після інкубації еритроцити відмивають і з них готують 5% завис в 0,9% розчині натрію хлориду. Потім з кожної пробірки переносять одну краплю (0,05 мл) завису на білу пластинку і до кожної краплі зависі додають одну краплю (0,05 мл) сироватки проби Кумбса, котру змішують з еритроцитами. Далі протягом 15 - 20 хв. спостерігають результат при похитуванні пластинки.
2.4.7. Останнє розведення, в якому спостерігається аглютинація (час спостереження 5 хв.), приймають за титр виявлених неповних резус-антитіл. Якщо аглютинація еритроцитів спостерігається у всіх розведеннях сироватки, це означає, що титр резус-антитіл вищий за 1:1024. У цих випадках слід продовжувати розведення сироватки і далі проводити дослідження, як вказано вище.
3. Дослідження сироватки на наявність неповних резус-антитіл за допомогою реакції конглютинації із застосуванням желатину (в пробірках)
3.1. Попередня обробка стандартних еритроцитів Кров для приготування еритроцитів беруть не більше ніж за 2 - 3 доби до дослідження в кількості 3 - 5 мл у звичайні пробірки без стабілізатора. Пробірки нумерують і пишуть на них прізвище, ініціали, групу крові і резус-належність особи, від якої взято кров. У такому разі звичайно після зсідання крові на дні пробірки залишається незначна кількість еритроцитів, які і використовують для дослідження. Еритроцити беруть з дна пробірки пастерівською піпеткою; якщо у такий спосіб захоплюється невелика кількість власної сироватки, це не впливає на хід реакції.
Якщо еритроцитів, що після зсідання крові залишилися вільними, недостатньо, то припускається інтенсивне струшування згустку для виділення додаткової кількості еритроцитів.
Можна брати кров з натрію цитратом. У цьому випадку еритроцити необхідно відмити 0,9% розчином натрію хлориду.
3.2. Техніка дослідження
3.2.1. У штатив вставляють тонкостінні пробірки висотою 10 см, які нумерують. Число і нумерація пробірок повинні відповідати числу і нумерації зразків еритроцитів, з якими досліджують сироватку.
3.2.2. У пробірки відповідно до нумерації вводять по одній краплі (0,05 мл) еритроцитів, приготованих як стандарти.
3.2.3. У всі пробірки додають по 2 краплі (0,1 мл) 10% розчину желатину, підігрітого до розрідження на водяній бані при температурі від 46 до 48 о C. (Розчин желатину необхідно старанно перевірити перед застосуванням. У разі помутніння, появи пластівців, а також втрати властивості застигати при температурі від +4 до +8 о C розчин желатину не придатний).
3.2.4. Після цього у всі пробірки вводять по 2 краплі (0,1 мл) досліджуваної сироватки, пробірки струшують для перемішування їх вмісту і ставлять на водяну баню при температурі від 46 до 48 о C на 10 хв. або в сухоповітряний термостат на 30 хв. при температурі від 46 до 48 о C.
3.2.5. У пробірки, вийняті з водяної бані, наливають 5 - 8 мл 0,9% розчину натрію хлориду. Вміст пробірок перемішують шляхом однодворазового перевертання їх і спостерігають результат за наявності чи відсутності аглютинації еритроцитів.
3.2.6. Обов'язковий контроль власної сироватки з власними еритроцитами.
3.3. Трактування результату
Результат реакції переглядають на світло неозброєним оком або під мікроскопом.
Наявність аглютинації в пробірках із зразками резус-позитивних еритроцитів і відсутність її з резус-негативними і власними еритроцитами вказує на наявність в досліджуваній сироватці неповних резус-антитіл.
Відсутність аглютинації з усіма зразками еритроцитів вказує на те, що неповні резус-антитіла анти-D(Rh0), C(rh') і E(rh''), а також c(hr') і e(hr'') не виявлено.
3.4. Титрування сироватки, яка містить неповні резус-антитіла
3.4.1. У штатив вставляють 10 пробірок з позначеннями 1:2, 1:4, 1:8 і т. д. до 1:1024.
3.4.2. У всі пробірки вносять по 2 краплі (0,1 мл) 0,9% розчину натрію хлориду.
3.4.3. У першу пробірку цією ж піпеткою вносять 2 краплі (0,1 мл) досліджуваної сироватки. З першої пробірки, після перемішування, дві краплі переносять в другу, з другої - в третю, з третьої - в четверту і так до останньої пробірки, з якої 2 краплі (0,1 мл) виливають. У результаті в пробірках утворюється розведення сироватки від 1:2 до 1:1024.
3.4.4. У всі пробірки додають по одній краплі (0,05 мл) суміші еритроцитів, одержаних від 4 - 5 резус-позитивних осіб і приготовлених, як вказано вище.
3.4.5. У всі пробірки вносять по 2 краплі (0,1 мл) 10% розчину желатину, попередньо підігрітого до розрідження в теплій воді при температурі від 46 до 48 о C.
3.4.6. Пробірки струшують і вміщують на водяну баню при температурі від 46 до 48 о C на 10 хв. або в сухоповітряний термостат на 30 хв.
3.4.7. Після виймання пробірок з водяної бані в них доливають по 5 - 8 мл 0,9% розчину натрію хлориду і спостерігають результат.
Останнє розведення, в якому спостерігається аглютинація, приймають за титр виявлених резус-антитіл.
Якщо аглютинація еритроцитів спостерігається у всіх розведеннях сироватки, це означає, що титр резус-антитіл вище за 1:1024.
У цих випадках слід продовжити розведення сироватки і далі проводити дослідження, як вказано вище.
Примітка. Для спрощення титрування за допомогою цього методу можна об'єднати операції, що описані в пунктах 3.4.4 і 3.4.5, і приготувати завис еритроцитів, одержаних від 4 – 5 резус-позитивних осіб, безпосередньо в розчині 10% желатину.
Еритроцитів повинно бути приблизно 10 - 20% по відношенню до загального об'єму. Цей завис додають по 2 краплі (0,1 мл) у всі пробірки з розведеннями досліджуваної сироватки антирезус і далі роблять, як вказано вище.
4. Дослідження сироватки на наявність повних резус-антитіл методом аглютинації в сольовому середовищі (в маленьких пробірках)
4.1. Попередня обробка стандартних еритроцитів
Кров для приготування стандартних еритроцитів беруть в кількості 1 - 2 мл в пробірки місткістю 8 - 10 мл, в яких знаходиться 3,8 - 5,0% розчин натрію лимоннокислого (з розрахунку 0,25 мл на 1,0 мл крові). Пробірки нумерують і пишуть на них прізвище та ініціали особи, від якої взято кров.
Після взяття крові в пробірки доливають доверху ізотонічний розчин натрію хлориду, вміст перемішують, центрифугують і відсмоктують відмивну рідину за швидкості ротора 1500 об./хв. протягом 5 хв. при кімнатній температурі. Таке відмивання повторюють двічі.
Можна брати кров і без стабілізатора. У цьому випадку після зсідання крові в пробірці звичайно залишається деяка кількість вільних еритроцитів. Якщо цих еритроцитів недостатньо, слід інтенсивно струснути згусток для відділення деякої кількості еритроцитів. Одержані таким чином еритроцити відмивають, як вказано вище.
З відмитих еритроцитів готують 2% завис в інших пробірках, взятих за кількістю зразків стандартних еритроцитів і відповідно пронумерованих.
Для приготування 2% завису в ці пробірки капають по 2,5 мл (49 крапель) 0,9% розчину натрію хлориду і в кожну пробірку відповідно до її нумерації переносять одну краплю еритроцитів. Вміст пробірок перемішують для одержання рівномірного 2% завису еритроцитів, який використовують для дослідження сироватки.
4.2. Техніка дослідження
4.2.1. В штатив вставляють ряд маленьких пробірок (висотою 2 - 2,5 см з внутрішнім діаметром 0,5 - 0,6 см, з гладким дном заокругленої форми) за кількістю зразків еритроцитів, з якими досліджують сироватку. Попередньо штатив покривають аркушем паперу, в якому роблять отвори для пробірок. Проти кожної пробірки на папері пишуть порядковий номер, а також прізвище, ініціали, групу крові і резус-належність особи, сироватку якої досліджують.
4.2.2. У всі пробірки вводять по одній краплі (0,05 мл) досліджуваної сироватки і по одній краплі 0,9% розчину натрію хлориду. Пробірки струшують для перемішування їх вмісту.
4.2.3. У пробірки, згідно з їх нумерацією і позначенням, вводять по одній краплі (0,05 мл) 2% завису стандартних еритроцитів.
4.2.4. Вміст пробірок знову перемішують і штатив з ними ставлять для інкубації в термостат при температурі 37 о C на 1 год.
4.2.5. Після інкубації штатив з пробірками виймають і спостерігають результат у вигляді наявності чи відсутності аглютинації еритроцитів.
4.2.6. Обов'язковий контроль аглютинації власних еритроцитів у разі додавання власної сироватки. При цьому аглютинації не повинно бути.
4.3. Оцінка результатів
Результат реакції визначають за допомогою лупи з 6 - 8-кратним збільшенням за формою осаду еритроцитів на дні пробірки.
Наявність аглютинації в пробірках з резус-позитивними зразками еритроцитів і відсутність її з резус-негативними і власними еритроцитами вказує на наявність в сироватці повних резус-антитіл. Відсутність аглютинації зі всіма зразками еритроцитів вказує на те, що повні резус-антитіла анти-D(Rh0), C(rh'), E(rh''), а також c(hr') і e(hr'') не виявлені.
4.4. Титрування сироватки, що містить повні антитіла Проводиться аналогічно до реакції конглютинації з додаванням желатину з використанням 2% завису тест-еритроцитів.
5. Феномен зони
За умови дуже високого ступеня імунізації організму резус-антитіла, що утворились, інколи дають феномен зони. Цей феномен полягає в тому, що не розведена або в незначному розведенні (1:2) сироватка крові таких осіб може не дати або дати слабку позитивну реакцію у разі взаємодії з резус-позитивними еритроцитами. Однак, якщо таку сироватку розвести, то у разі деякого розведення (частіше всього 1:8, 1:16, а іноді і більше) резус-антитіла в ній стають активними і дають добре виявлену позитивну реакцію. Найрідше феномен зони буває вираженим підчас випробування сироватки непрямою пробою Кумбса. Тому, а також у зв'язку з великою її чутливістю, проба Кумбса є дуже цінною реакцією для виявлення неповних резус-антитіл.
Якщо всі методи, включаючи непряму пробу Кумбса, не виявляють в сироватці резус-антитіл, а в анамнезі у особи, кров якої досліджують, є дані щодо сенсибілізації до резус-фактора, то для виключення феномена зони слід випробувати цю сироватку в розведеннях. Для цього сироватку розводять і випробовують, як вказано для кожного методу в розділах "Титрування сироватки".
Якщо під час спостереження результату в будь-яких розведеннях сироватки зазначається позитивна реакція, це означає, що в досліджуваній сироватці є антитіла. У цих випадках для подальшого дослідження сироватки її слід розвести, вибравши те розведення, в якому спостерігається найбільш виявлена позитивна реакція.
Розводити сироватку слід 0,9% розчином натрію хлориду.
Дослідження розведеної сироватки проводять, як вказано вище, для кожного методу. Під час встановлення висоти титру враховують загальне розведення нативної сироватки починаючи з 1:2.
6. Специфічність резус-антитіл
Сироватки, що дали позитивний результат з усіма зразками резуспозитивних еритроцитів, можуть мати як виключно антитіла антиD-(Rh0), так і одночасно антитіла до декількох антигенів: анти-C + D(Rh0'), анти-D + E(Rh0'') або анти-C + D + E(Rh0''').
У деяких випадках досліджувані сироватки, що мають резус-антитіла, можуть викликати аглютинацію вибірково - не всіх резус-позитивних еритроцитів. Це може бути пов'язано з тим, що в досліджуваній сироватці є антитіла не анти-D(Rh0) (які найчастіше зустрічаються), а анти-C(rh') або анти-E(h'').
Позитивний результат може також спостерігатись і з резуснегативними еритроцитами за рахунок інших антигенів за системою резус-c(hr'), e(hr'') або антигенів інших систем.
Для встановлення специфічності резус-антитіл необхідно спеціальне дослідження сироватки з набором стандартних еритроцитів, включаючи рідкі фенотипи: cDe(Rh0), Cde(rh') і cdE(rh''), а також резуснегативні зразки, включаючи ті, що містять, і ті, що не містять антигенів Келл (K) і Даффі (Fy). З ними ж проводять і титрування сироватки.
7. Оцінка результатів визначення резус-антитіл
Висновок щодо наявності в сироватці резус-антитіл можна зробити у разі позитивного результату, одержаного при будь-якому методі дослідження.
Висновок щодо відсутності у сироватці резус-антитіл можна зробити тільки у разі негативного результату, одержаного при дослідженні не менш ніж двома методами, одним з яких є будь-який метод виявлення неповних резус-антитіл, а другим – реакція аглютинації в сольовому середовищі, що виявляє повні резус-антитіла. У такому разі слід ураховувати можливий феномен зони.