ІНСТРУКЦІЯ
з визначення резус-належності крові
Система резус включає 3 пари антигенів еритроцитів: D(Rh0) і d(Hr0), C(rh') і c(hr'), E(rh'') і e(hr''), які генетично зумовлені і представлені трьома парами алеломорфних генів на парі хромосом. Різні комбінації антигенів системи Rh на поверхні еритроцитів створюють 18 теоретично можливих фенотипів, тобто групп крові за системою Rh.
У трансфузіологічній практиці підлягають обліку, в першу чергу, три антигени - D(Rh0), C(rh') і E(rh''). Особливе значення має антиген D, який є сильним імуногеном. Ці антигени можуть знаходитися на еритроцитах людей разом або окремо, утворюючи сім різних співвідношень, а також можуть бути взагалі відсутніми (генотип ccddee). Ці відмінності дозволяють умовно розділити еритроцити людей на 8 груп. З них 4 групи, в яких знаходиться антиген D(Rh0), є резус-позитивними (Rh+), а 4 групи, які не мають антигену D(Rh0), - резус-негативними (Rh-).
На відміну від системи AB0, у сироватці крові людей практично не буває природних антитіл до антигенів системи Rh. Антитіла системи Rh мають виключно імунний характер і утворюються в результаті Rh-несумісної трансфузії чи вагітності. Врахування груп крові за системою Rh є важливим для практики трансфузійної медицини.
1. Визначення резус-належності за допомогою стандартних сироваток
1.1. Загальні положення
Визначення резус-належності проводить спеціально підготовлений лікар або лікар-лаборант, який має посвідчення встановленого зразка, видане спеціалізованою установою або закладом (профільним НДІ, центром крові).
Визначення резус-належності проводять у реакції аглютинації за допомогою алоімунних сироваток або моноклональних реагентів.
Особи, які мають D(Rh0)-антиген умовно називаються резус-позитивними (їх 85% серед білого населення Європи), а ті, які його не мають - резус-негативними (Rh-).
Визначення резус-належності крові донорів проводять у два етапи: спочатку кров донорів досліджують стандартною сироваткою анти-D(Rh0) або моноклональними реагентами анти-D-супер, а потім кров тих донорів, які дали негативну реакцію з сироваткою анти-D(Rh0), досліджують додатково із стандартними сироватками антирезус, що містять, крім анти-D(Rh0), антитіла анти-C(rh') і анти-E(rh''). Антитіла анти-C(rh') і анти-E(rh'') можуть знаходитись у сироватці як у чистому вигляді, так і в суміші з антитілами D(Rh0), наприклад: анти-D(Rh0) + C(rh'), анти-D(Rh0) + E(rh'') або анти-D(Rh0) + С(rh') + E(rh'').
У відсотках представлено частоту поширення резус-позитивних і резус-негативних варіантів, які зустрічаються серед населення європейського регіону (табл. 5).
Таблиця 5
Найбільш поширені групи крові за системою резус
Резус-позитивні (Rh+) 86% |
Резус-негативні (Rh-) 14% |
CDE(Rh0''') |
cde(rh0) |
CDe(Rh0') |
Cde(rh') |
cDE(Rh0'') |
cdE(rh'') |
cDe(Rh0) |
CdE(rh' rh'') |
Дослідження фенотипу резус необхідно проводити у жінок з підозрою на ізосенсибілізацію та у вагітних жінок з підозрою на резус-конфліктну вагітність.
Результат визначення резус-належності крові донорів фіксують в особовому журналі та на титульній сторінці донорської картки з вказанням дати і за підписом осіб, які проводили визначення.
Результат визначення резус-належності крові хворих та інших осіб записують у спеціальний журнал та на бланк з вказанням дати та за підписом особи, яка проводила визначення. Цей бланк підклеюють до історії хвороби і, крім того, результат, який вказаний на цьому бланку, лікуючий лікар фіксує на титульній сторінці історії хвороби і скріплює підписом з зазначенням дати.
1.1.1. Облік групової належності сироватки антирезус
Сироватки антирезус виготовляють звичайно у вигляді універсальних, тобто позбавлених групових антитіл. Такі сироватки придатні для визначення резус-належності крові людей будь-якої групи за системою AB0. Однак за певних обставин сироватки антирезус виготовляють з крові різних груп за системою AB0. У цих випадках у разі визначення резус-фактора необхідно враховувати групову специфічність сироватки.
§ Сироваткою антирезус групи 0(I) визначається резус-фактор тільки в еритроцитах групи 0(I);
§ сироваткою антирезус групи A(II) визначається резус-фактор тільки в еритроцитах 0(I) і A(II); сироваткою антирезус групи B(III) визначається резус фактор тільки в еритроцитах груп 0(I) і B(III);
§ сироваткою антирезус групи AB(IV) і спеціально виготовленою - універсальною, визначається резус-фактор в еритроцитах групи AB(IV) і будь-якої іншої групи крові.
1.1.2. Контрольні дослідження
Під час кожного дослідження для перевірки специфічності і активності сироватки антирезус необхідно ставити контроль.
Для контролю застосовують стандартні резус-позитивні еритроцити групи 0(I) або тієї ж групи, що і досліджувана кров, і стандартні резус-негативні еритроцити обов'язково тієї ж групи, що і досліджувана кров.
1.1.3. Особливості стандартних сироваток антирезус
Стандартні сироватки для визначення резус-належності можуть мати різні за формою резус-антитіла - повні і неповні. Кожні з цих антитіл активні тільки в особливих умовах, тому методика визначення резус-фактора залежить від того, які резус-антитіла знаходяться в стандартній сироватці.
1.1.4. Застосування двох серій стандартних сироваток
Визначення резус-фактора обов'язково треба проводити двома серіями стандартних сироваток антирезус. Якщо стандартні сироватки активні в різних умовах (наприклад, одна з них містить повні антитіла і тому активна в сольовому середовищі, а друга містить неповні антитіла і активна в колоїдному середовищі - в желатині або поліглюкіні), то визначення резус-належності слід проводити різними методами, як вказано в супровідній інструкції для кожної серії сироватки.
1.1.5. Різні методи визначення резус-фактора за допомогою стандартних сироваток
Таким чином, метод визначення резус-фактора залежить від форми резус-антитіл у стандартній сироватці та способу її виготовлення.
Видаючи сироватку антирезус, до неї прикладають коротку супровідну інструкцію з описом того методу, для якого призначена ця сироватка.
1.2. Визначення резус-фактора D(Rh0) за допомогою реакції конглютинації із застосуванням желатину (в пробірці з підігрівом до 46 - 48 о C)
1.2.1. Спеціальне обладнання
Стандартні сироватки антирезус з неповними антитілами.
Стандартні еритроцити для контролю. Центрифужні або будь-які інші тонкостінні пробірки ємністю 10 - 15 мл. Водяна баня при температурі від 46 до 48 о C або сухоповітряний термостат при температурі від 46 до 48 о C. 10% розчин желатину. Желатин можна зберігати з консервантами: натрію сульфацилом (альбуцидом) з розрахунку 100 мг альбуциду на 10 мл 10% розчину желатину або з натрію азидом з розрахунку 10 мг на 10 мл 10% розчину желатину.
1.2.2. Попередня обробка досліджуваної крові і стандартних еритроцитів
Кров для дослідження слід брати в кількості 2 - 5 мл в пробірку без стабілізатора. На пробірці підписати прізвище,
ініціали і групу крові особи, від якої взято кров. Звичайно після зсідання крові на дні пробірки лишається невелика кількість вільних еритроцитів, які слід використовувати для дослідження. Якщо цих еритроцитів недостатньо, слід струснути згусток для відділення більшої кількості еритроцитів.
Якщо брати кров з 3,8 - 5,0% розчином натрію цитрату (0,25 мл натрію цитрату на 1 мл крові), гепарином або іншим стабілізатором, еритроцити необхідно відмити, для чого в пробірку доливають до верху 0,9% розчин натрію хлориду, вміст її перемішують і центрифугують при 1500 об./хв. протягом 5 хв. при кімнатній температурі. Для дослідження потрібно використовувати відмиті еритроцити.
Для визначення резус-належності кров можна брати з місця проколу пальця скляною паличкою і негайно вводити в пробірку з сироваткою антирезус, змішаною з желатином у співвідношенні 1:2.
Для визначення резус-належності кров можна зберігати в холодильнику протягом трьох діб при температурі
+ (6 ± 2) о C.
1.2.3. Техніка визначення
У разі використання двох серій сироватки антирезус у штативі розміщують три ряди центрифужних або будь-яких інших пробірок (об'ємом не менше 10 мл) у кожному ряді за числом досліджуваних зразків еритроцитів і по дві пробірки для стандартних резус-позитивних і резус-негативних еритроцитів. На кожній з трьох пробірок надписують прізвище та ініціали особи, кров якої буде досліджено. В однаково позначені пробірки (три ряди) вводять по одній краплі (0,05 мл) досліджуваних еритроцитів, а в контрольні - по одній краплі (0,05 мл) стандартних (Rh0+) і (Rh0-) еритроцитів.
У всі пробірки додають по дві краплі (0,1 мл) 10% розчину желатину, попередньо підігрітого до розчинення на водяній бані при температурі від 46 до 48 о C.
У всі пробірки першого ряду додають по одній краплі (0,05 мл) сироватки антирезус однієї серії, у всі пробірки другого ряду – по 1 краплі (0,05 мл) сироватки антирезус другої серії. Третій ряд є контролем для виключення можливого неспецифічного склеювання досліджуваних еритроцитів, наприклад, за рахунок ауто-, теплових або холодових антитіл, і туди сироватку антирезус не додають.
Вміст пробірок перемішують струшуванням, і штатив з пробірками ставлять на водяну баню при температурі від 46 до 48 о C на 5 - 10 хв. або в сухо-повітряний термостат при тій же температурі на 30 хв.
Після виймання пробірок з водяної бані або з термостату до них додають 5 - 8 мл 0,9% розчину натрію хлориду і перемішують вміст шляхом 1 - 2-кратного перевертання пробірок.
1.2.4. Оцінка результатів
Пробірки переглядають на світлі неозброєним оком або через лупу з двократним збільшенням. Результат оцінюють за наявністю або відсутністю аглютинації еритроцитів.
За умови позитивного результату аглютинати легко розрізняються у вигляді червоних грудочок на прозорому, майже знебарвленому, тлі рідини.
За умови негативного результату в пробірці видно рівномірно забарвлену в світло-червоний колір, дещо опалесціюючу, рідину.
Зразки еритроцитів, що дали аглютинацію з сироваткою анти-D(Rh0), є резус-позитивними (Rh0+).
Зразки еритроцитів, що не дали аглютинації з сироваткою анти-D(Rh0), - резус-негативні (Rh0).
Однак результати враховують як вірогідні за умови співпадання їх в обох серіях сироватки антирезус і після перевірки контрольних зразків, які підтверджують специфічність і активність сироватки антирезус, тобто за відсутності аглютинації зі стандартними резус-негативними еритроцитами однойменної групи і наявності аглютинації зі стандартними резус-позитивними еритроцитами однойменної групи і групи 0(I). У пробірках третього (контрольного) ряду аглютинації не повинно бути.
Наявність аглютинації в будь-якій пробірці контрольного ряду свідчить про неспецифічність реакції. За цих умов позитивний результат з сироваткою антирезус не може бути врахований як вірогідний. У таких випадках для визначення резус-належності слід використовувати сироватку антирезус з повними антитілами або попередньо відмити еритроцити теплим 0,9% розчином натрію хлориду для вимивання з них аутоантитіл. За сумнівного результату необхідно проводити мікроскопічне дослідження.
1.3. Визначення резус-фактора D(Rh0) за допомогою стандартного універсального реагенту (в пробірках без підігріву)
1.3.1. Спеціальні реагенти та обладнання
- стандартний універсальний реагент антирезус - анти-Rh0(D);
- стандартні еритроцити для контролю;
- центрифужні або інші пробірки місткістю 8 - 10 мл.
1.3.2. Попередня обробка досліджуваної крові
Попередня обробка досліджуваної крові не потрібна. Може бути використана кров, взята безпосередньо перед дослідженням з місця уколу пальця, консервована кров і осад еритроцитів в пробірці після утворення згустку крові, взятої без стабілізатора.
Дозволяється зберігати кров протягом 3 діб при температурі + (6 ± 2) о C.
1.3.3. Техніка виконання реакції
У штатив ставлять 2 ряди пробірок за кількістю досліджуваних зразків еритроцитів у кожному ряді і по 2 пробірки для контрольних досліджень - стандартних резус-позитивних і резус-негативних еритроцитів. На пробірках надписують прізвище і ініціали особи, кров якої досліджують. Відповідно позначають і контрольні пробірки.
У всі пробірки 1-го ряду вносять по 2 краплі (0,1 мл) стандартного універсального реагенту антирезус.
У всі пробірки 2-го ряду вносять по 2 краплі (0,1 мл) 0,9% розчину натрію хлориду і по одній краплі (0,05 мл) 33% розчину поліглюкіну.
У кожну пару пробірок вносять відповідно до позначення по 1 краплі (0,05 мл) досліджуваної крові, стандартних резус-позитивних і резус-негативних еритроцитів.
Вміст пробірок перемішують струшуванням і потім поволі повертають по осі, нахиляючи майже до горизонтального положення так, щоб вміст розпливався по стінках. Таке розпливання крові по стінках пробірок робить реакцію більш вираженою. Як правило, аглютинація настає вже протягом 1-ї хвилини, але для утворення стійкого комплексу антиген - антитіло і чітко вираженої реакції, а також зважаючи на можливість сповільненої реакції у разі слабкої аглютинабельності еритроцитів, контакт еритроцитів з реагентом при повертанні пробірок має тривати не менше 3 хв.
Через 3 хв. в пробірки додають по 2 - 3 мл 0,9% розчину натрію хлориду і перемішують вміст 2 - 3-кратним повертанням пробірок (не струшувати!).
1.3.4. Оцінка результатів
Пробірки передивляються на світлі неозброєним оком або через лупу з 2-кратним збільшенням. Результат оцінюють за наявністю або відсутністю аглютинації еритроцитів.
За наявності аглютинації у вигляді великих грудочок або пластівців із склеєних еритроцитів на тлі освітленої рідини досліджувану кров можна вважати резус-позитивною (Rh+). У разі відсутності аглютинації (в пробірці зберігається гомогенне забарвлення) досліджувану кров можна вважати резус-негативною (Rh-). Однак ці результати слід вважати вірогідними тільки після перевірки контрольних зразків, тобто у разі позитивної реакції зі стандартними резус-позитивними еритроцитами і негативної – з резус-негативними, а також після перегляду результатів у 2-му контрольному ряді.
У всіх пробірках 2-го контрольного ряду аглютинації не повинно бути.
Наявність аглютинації в будь-якій пробірці контрольного ряду вказує на неспецифічне склеювання еритроцитів і не дозволяє враховувати результат дослідження як вірогідний.
У таких випадках для визначення резус-належності слід застосовувати іншу сироватку антирезус, включаючи сироватку з повними антитілами, або відмити еритроцити теплим 0,9% розчином натрію хлориду для вимивання з них аутоантитіл.
1.4. Визначення резус-фактора D(Rh0) за допомогою реакції аглютинації в сольовому середовищі в маленьких пробірках або в планшеті для імунологічних реакцій (реакція придатна для роботи тільки з сироваткою, що має повні резус-антитіла)
1.4.1. Спеціальні реагенти та обладнання
- стандартні сироватки антирезус з повними антитілами;
- стандартні еритроцити для контролю;
- пробірки висотою 2 - 2,5 см і діаметром 0,5 - 0,6 см з гладким дном заокругленої форми або планшети з заглибинами такої ж конфігурації;
- лупа з 6 - 8-кратним збільшенням;
- термостат (37 о C).
1.4.2. Попередня обробка досліджуваної крові і стандартних еритроцитів
Кров для дослідження беруть у кількості 2 - 3 мл у звичайні пробірки, в яких знаходиться 0,25 мл (5 крапель) 3,8 - 5,0% розчину натрію цитрату або іншого стабілізатора. На пробірці надписують прізвище, ініціали та групу крові особи, від якої взято кров.
Еритроцити необхідно відмити, для чого в пробірки доливають доверху 0,9% розчин натрію хлориду, вміст їх перемішують і центрифугують при швидкості обертання ротора 1500 об./хв. протягом 5 хв.
Можна брати кров без стабілізатора. У такому разі після зсідання в пробірці залишається деяка кількість вільних еритроцитів. Одержані за такою методикою еритроцити відмивають, як вказано вище. З відмитих еритроцитів готують 2% завис, для чого одну краплю еритроцитів переносять у відповідно позначену пробірку, в якій знаходиться 49 крапель 0,9% розчину натрію хлориду.
Припустимо зберігати кров у холодильнику протягом 3 діб при температурі +(6 ± 2)оC.
1.4.3. Техніка визначення
У штатив встановлюють два ряди маленьких пробірок, в кожному ряді за кількістю досліджуваних зразків еритроцитів і дві – для контролю. Попередньо штатив накривають аркушем паперу. На ньому злегка наколюють отвори, крізь які і встановлюють пробірки.
Проти кожної пари пробірок на папері надписують прізвище, ініціали особи, кров якої будуть досліджувати.
У всі пробірки першого ряду вносять по 1 краплі (0,05 мл) сироватки антирезус однієї серії, у всі пробірки другого ряду – по 1 краплі (0,05 мл) сироватки антирезус другої серії, у всі пробірки обох рядів - по 1 краплі 0,9% розчину натрію хлориду.
У відповідно позначені пари пробірок додають по 1 краплі (0,05 мл) 2% завису досліджуваних еритроцитів, а в контрольні пробірки - по 1 краплі (0,05 мл) 2% завису контрольних (стандартних резус-позитивних і резус-негативних) еритроцитів.
Вміст пробірок ретельно перемішують струшуванням, і штатив з ними ставлять у термостат за температури 37 о C на 1 год. За цей час еритроцити осідають на дно, попередньо увійшовши в контакт з сироваткою антирезус.
1.4.4. Оцінка результатів
Пробірки слід розглядати по повздовжній осі над джерелом світла, закритим матовим склом. Результат оцінюють за наявністю або відсутністю аглютинації еритроцитів, що проявляється в різній формі їх осаду на дні пробірки. У разі позитивного результату осад еритроцитів розташовується на дні пробірки нерівномірним шаром. Видно шорсткість, губчастість або зернистість його структури. Контури осаду ніколи не бувають рівними, вони зігнуті, іноді згорнуті до середини. У деяких випадках еритроцити розташовуються у вигляді хвилястого віночка навколо більш світлої центральної частини.
У разі негативного результату осад еритроцитів розташовується рівномірним шаром без шорсткостей, інколи з невеликим просвітленням у центрі. Межі його являють собою правильно окреслене коло.
Діаметр осаду у разі негативного результату завжди менший, ніж у разі позитивного.
Зразки еритроцитів, що дають аглютинацію із сироваткою анти-D(Rh0), є резус позитивними (Rh+), зразки еритроцитів, що не дають аглютинації з сироваткою анти-D(Rh0) - резус-негативні (Rh-). Однак результат враховують як вірогідний за умови співпадання їх в обох серіях сироватки антирезус і після перевірки контрольних зразків, які підтверджують специфічність і активність сироватки антирезус, тобто за відсутності аглютинації зі стандартними резус-негативними еритроцитами однойменної групи і наявності аглютинації зі стандартними резус-позитивними еритроцитами однойменної групи або групи 0(I).
Примітка. Повні антитіла не виявляють слабкий різновид фактора D^U.
1.4.5. Повторне використання сироватки
Після визначення резус-фактора з усіх пробірок обережно відсмоктують сироватку (еритроцити залишаються на дні) і збирають її в ампулу або в пробірку.
Цю сироватку можна повторно декілька разів застосовувати для визначення резус-фактора, поки активність її не вичерпається, тобто поки вона буде давати чітку аглютинацію зі стандартними резус-позитивними еритроцитами і негативну - зі стандартними резус-негативними еритроцитами.
1.5. Оцінка результатів визначення резус-належності стандартними сироватками
1.5.1. Під час визначення резус-належності двома серіями стандартних сироваток у тих випадках, коли вони використовуються різними методами, результат враховують як вірогідний за умови співпадання його в обох серіях досліджень після перевірки контрольних зразків, які підтверджують специфічність і активність кожної серії сироватки антирезус, тобто за відсутності аглютинації зі стандартними резус-негативними еритроцитами однойменної групи і наявності аглютинації зі стандартними резус-позитивними еритроцитами однойменної або групи 0(I) і в контрольних пробах без сироватки (реагенту) антирезус.
1.5.2. Якщо під час визначення резус-належності спостерігається слабка або сумнівна реакція, то слід повторно досліджувати кров даної особи тими ж та іншими серіями сироватки антирезус або моноклональними реагентами, а також використовувати сироватку, що вміщує повні антитіла.
Якщо за таких умов усі серії сироваток, що містять неповні антитіла, дадуть також слабку або сумнівну реакцію, а з повними антитілами реакція буде негативною, це означає, що еритроцити мають слабку різновидність антигену резус, так званий фактор D^U, який зустрічається в популяції з частотою близько 1%. У цих випадках резус-належність крові хворого або вагітної жінки оцінюють, як резус-негативну (Rh-), а резус-належність крові донора - як резус-позитивну (Rh+), не допускаючи, таким чином, переливання його крові резус-негативним реципієнтам.
1.5.3. Інколи зустрічаються зразки еритроцитів, що дають слабко виражену реакцію. У цих випадках слід повторно досліджувати їх кількома серіями сироваток антирезус високої активності або моноклональними антитілами (реагенти анти-D-супер).
1.5.4. Для визначення резус-належності крові донорів недостатньо розділення їх тільки на резус-позитивних і резус-негативних за сироваткою анти-D(Rh0), а необхідно додатково досліджувати сироватками, що мають антитіла анти-C(rh') і анти-E(rh''), або моноклональними антитілами.
До числа резус-негативних донорів зараховують тільки тих осіб, кров яких не має жодного з вказаних антигенів.
1.5.5. Визначення антигенів резус-C(rh'), E(rh''), c(hr') і e(hr'') проводять сироватками, що мають антитіла відповідної специфічності, або моноклональними реагентами. Ці антитіла можуть бути в сироватці як у чистому вигляді, так і в різних співвідношеннях.
Ці дослідження проводять тими ж методами, що і визначення резус-фактора - D(Rh0). Як позитивний контроль використовують стандартні еритроцити, що мають відповідний антиген.
2. Визначення антигенів системи резус за допомогою моноклональних антитіл
2.1. Характеристика моноклональних тест-реагентів, призначених для виявлення антигенів системи резус у людей Моноклональні реагенти (антитіла) призначені для виявлення окремих антигенів системи резус на еритроцитах людини. Їх можна застосовувати замість ізоімунних сироваток або паралельно з ними.
Моноклональні тест-реагенти - це моноклональні антитіла, які виробляються гетерогібридомою. Одержують моноклональні антитіла з культуральної рідини гібридомних клітин-продуцентів. Технологія виготовлення тест-реагентів виключає можливість їх контамінації патогенними для людини вірусами.
Моноклональні антитіла анти-D-супер призначені для виявлення на еритроцитах людини антигену D(Rh0) і використовуються в серологічних тестах замість або паралельно з імунною
анти-D-сироваткою.
Моноклональні анти-D-антитіла випускають у вигляді повних (IgM) та неповних (IgG) антитіл.
Оскільки IgM-антитіла не аглютинують деякі зразки еритроцитів із слабким варіантом D (зокрема, D^U), необхідно такі "негативні" еритроцити додатково досліджувати в желатиновому тесті або непрямій пробі Кумбса з використанням анти-D-реагентів, що мають IgG-антитіла. Такими реагентами є поліклональні сироватки або моноклональні анти-D-IgG-реагенти.
Анти-D-IgM-антитіла викликають пряму аглютинацію еритроцитів, які мають D-антиген, і можуть використовуватись в будь-якій модифікації прямої аглютинації: в пробірках, на площині, в мікроплатах.
Моноклональні антитіла анти-C-супер вміщують антитіла, здатні викликати пряму аглютинацію еритроцитів, що несуть на собі C(rh')-антиген системи резус. Даний реагент не має антитіл іншої специфічності і тому придатний для виявлення C-антигену в еритроцитах будь-якої групи крові за системою AB0.
Моноклональні анти-C-антитіла можуть бути використані в реакціях прямої аглютинації в пробірках, на площині, в мікроплатах. У разі застосування тесту на площині, скло необхідно попередньо злегка підігріти.
Моноклональні анти-CDE антитіла виготовляють із моноклональних антитіл (IgM та IgG) для виявлення в еритроцитах антигену C (один IgM-клон), D-антигену (один IgM-клон та один IgG-клон) і антигену E (один IgM-клон) шляхом прямої аглютинації в пробірках, на площині та в мікроплатах.
Слід підкреслити, що D^U-позитивні еритроцити також аглютинуються цим реагентом. Проте в разі негативної реакції слабкий DU фенотип можна виявити в непрямому тесті Кумбса з використанням IgG-компонентів анти-CDE моноклональних антитіл.
Реакцію з моноклональними анти-резус-тест-реагентами можна ставити в пробірках, на площині та в мікроплатах.
2.2. Тест в пробірках
2.2.1. Одну краплю 3 - 5% завису еритроцитів сполучають з краплею моноклонального рідкого тест-реагенту.
2.2.2. Пробірки струшують до повного перемішування реагентів, після чого центрифугують при швидкості ротора 1000 об./хв. протягом 1 хв. Допускається попередня (перед центрифугуванням) інкубація при кімнатній температурі або при температурі 37о C протягом 30 хв.
2.2.3. Обережно струшують осад у пробірках.
У разі негативного результату осад еритроцитів легко розбивається, створюючи гомогенну непрозору суспензію.
Якщо результат позитивний, осад не розбивається, залишаючись у вигляді одного або декількох великих аглютинатів на тлі прозорої рідини.
2.3. Реакція аглютинації на площині (найбільш прийнятна в лабораторній практиці)
2.3.1. На скляну площину зі змочуваною поверхнею наносять дві краплі тест-реагенту анти-резус (0,1 мл), 1 краплю досліджуваної крові (0,05 мл) і ретельно змішують.
2.3.2. Через 20 - 30 сек. починають погойдувати площину.
Чітка аглютинація починається і спостерігається досить чітко за 60 сек. Результат реакції слід враховувати через три хвилини, уникаючи висихання краплини.
2.4. Реакція аглютинації в мікроплатах
2.4.1. В комірку мікроплати капають одну краплину тест-реагенту анти-резус і додають до неї одну краплю 3 - 5% завису еритроцитів. Ретельно перемішують вручну або вібратором для мікроплат.
2.4.2. Центрифугують при швидкості обертання ротора 1000 об./хв. протягом 1 хв. або попередньо інкубують 30 хв. при кімнатній (від 20 до 27о C) температурі.
2.4.3. Злегка струшують мікроплату. Якщо результат негативний, осад розбивається у вигляді рівномірного забарвлення рідини.
У разі позитивного результату осад залишається у вигляді великих аглютинатів.
2.4.4. Відчитування результатів необхідно проводити у прохідному світлі з дзеркалом або з використанням спеціального обладнання, наприклад, апарату автоматичного обліку мікроплат.
2.5. Непрямий тест Кумбса для визначення D^U-антигену
2.5.1. Готують 3 - 5% суспензію досліджуваних еритроцитів в 0,9% розчині натрію хлориду.
2.5.2. У пробірці сполучають 1 краплю суспензії еритроцитів з 1 краплею моноклональних анти-CDE-антитіл і ретельно перемішують реагенти.
2.5.3. Ставлять на водяну баню при температурі 37 о C на 15 хв.
2.5.4. Після інкубації еритроцити тричі відмивають 0,9% розчином натрію хлориду. Для цього в пробірки доливають до верху 0,9% розчин натрію хлориду, вміст їх перемішують і центрифугують при швидкості 1500 об./хв. протягом 5 хв.
2.5.5. Додають до осаду еритроцитів 2 краплі антиглобулінової сироватки Кумбса, ретельно перемішують.
2.5.6. Центрифугують протягом 1 хв. при швидкості обертання ротора 1000 об./хв. при кімнатній температурі.
2.5.7. Струшують пробірку та враховують аглютинацію.
2.5.8. Аглютинація еритроцитів свідчить про наявність антигена D^U.
У разі негативного результату реакції ставлять паралельний контроль з D-позитивними та D-негативними еритроцитами в пробі Кумбса.
Примітка. Інші антигени за системою резус, такі, наприклад, як C(rh'), c(rh'), E(rh''), e(hr''), а також антигени інших систем (Келл) виявляються ізоімунними сироватками, що мають відповідну специфічність. У перспективі розвитку біотехнології можлива заміна ізоімунних сироваток повністю моноклональними реагентами, переваги яких на сьогодні цілком очевидні.
3. Помилки при визначенні Rh-фактора
3.1. Помилки організаційно-технічного характеру
- неправильний вибір антирезусних сироваток за групповою належністю;
- помилковий порядок розміщення сироваток, реагентів або дослідної крові у штативах;
- неправильне співвідношення між сироваткою і еритроцитами (еритроцитів повинно бути приблизно в 10 разів менше ніж сироватки);
- недотримання необхідної температури в водяній бані (при температурі нижчій від 42 о C аглютинація може не наступити, при вищій від 48 о C краплини швидко висохнуть);
- недотримання часу, необхідного для проведення реакції;
- висновок робиться з висохлої краплі;
- використання для визначення резус-фактора старої, гемолізованої або інфікованої крові;
- визначення резус-належності за допомогою однієї серії антирезусної сироватки.
3.2. Помилки, пов'язані з використанням недоброякісних сироваток
- використання протермінованих сироваток;
- використання малоактивних сироваток;
- використання забруднених, інфікованих сироваток.
3.3. Помилки, зумовлені біологічними особливостями дослідної крові
- феномен поліаглютинабельності еритроцитів. Поліаглютинацію вдається усунути за допомогою відмивання еритроцитів, хоч і не завжди;
- наявність антигену D^U (слабка різновидність антигену D).
Еритроцити з цим аглютиногеном дають дуже нечітку аглютинацію зі стандартними антирезусними сироватками та з МКА. Реципієнтів з антигеном DU рахують резус-негативними, донорів - резус-позитивними;
- зниження рівня резус-аглютиногенів при деяких захворюваннях (хвороби системи крові, печінки, нирок, імунної системи).